Nouveau : microscopie multiphotonique

23/04/2018

Quel est le principal avantage de la microscopie multiphotonique ?

Ce type de microscopie permet une profondeur de pénétration plus importante que la microscopie confocale classique et réduit fortement le photoblanchiment. Ceci est particulièrement intéressant pour l'observation de tissus épais, de tranches de cerveau, d'embryons, d'organes entiers ou même d'animaux entiers, anesthésiés.

 

A1R-Multiphoton


Comment ce microscope fonctionne-t-il ?

En microscopie confocale conventionnelle, nous utilisons l'énergie des photons, d'une longueur d'onde spécifique, pour exciter des fluorophores particuliers. Par exemple, nous utilisons des photons de longueur d'onde de 488 nm pour exciter le fluorophore Alexa 488. Selon les lois de la physique, l'énergie des photons lumineux est inversement proportionnelle à leurs longueurs d'onde. Par conséquent, 2 photons ayant une longueur d'onde deux fois plus longue que 488 nm auront la même quantité d'énergie qu'un photon unique de 488 nm. C'est ce que fait la microscopie multiphotonique: elle utilise deux photons de plus grande longueur d'onde pour exciter les fluorophores! Les longueurs d'onde plus longues peuvent pénétrer beaucoup plus profondément dans les tissus, ce qui permet de visualiser la fluorescence beaucoup plus profondément et sans photoblanchiment!

Le Nikon AR1 MP + peut être aussi utilisé pour visualiser certaines structures moléculaires sans qu'elles soient marquées en fluorescence en utilisant une technique appelée "la microscopie d'imagerie de seconde harmonique (SHIM)". En effet, lorsque les photons frappent des structures bien ordonnées, ils se combinent et produisent un phénomène appelé la génération de deuxième harmonique (SHG). Ces deuxièmes harmoniques peuvent être détectées par le Nikon AR1 MP + de la même manière que ce microscope détecte la fluorescence provenant d'un fluorophore.

Les structures biologiques bien ordonnées, telles que les fibres de collagène de type I et II, les assemblages de microtubules - y compris les centrosomes et les fuseaux mitotiques - et la myosine musculaire produisent des harmoniques secondaires et peuvent donc être imagés avec le microscope Nikon AR1 MP + sans marquage fluorescent.

Pour l'instant, le Nikon AR1MP + se trouve dans une pièce temporaire et ne peut donc être utilisé que pour l'imagerie de tissus fixés. Dans les mois à venir, il sera déplacé dans un espace dédié aux petits animaux vivants: l'imagerie in vivo y sera donc également possible.

 

figure 1

 

Figure 1: sarcomeres of zebrafish heart

Sarcomeres of the zebrafish heart obtained by SHIM (sarcomeres: green, nuclei: blue)

 

 

figure 2

Figure 2: collagen fibres in mouse skin after implantation of a polymeric device. Images were obtained by SHIM (collagen: blue, autofluorescence: green)

 

 

Video: 3D reconstruction of a portion of a fli1:EGFP zebrafish heart, acquired by multiphoton microscopy. Zebrafish fli1 promoter drives the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in all blood vessels.

 

 

Cet équipement a été acquis grâce à l'aide du Fonds Léon Fredericq

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GIGA-Cell Imaging Platform - Sandra Ormenese - imaging.giga@uliege.be